Question

【題目】pBV220載體是我國預防醫(yī)學科學院病毒研究所自行構(gòu)建并廣泛應(yīng)用的大腸桿菌溫控載體，大小為3 666 bp（bp表示堿基對），其結(jié)構(gòu)如下圖所示。圖中PRPL是啟動子，rrB是基因轉(zhuǎn)錄終止信號，Ampr是氨芐抗性基因，ori是質(zhì)粒復制起點，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ等為各種限制性內(nèi)切酶。請據(jù)圖回答下列有關(guān)問題：

（1）基因工程的核心步驟是____________________________________。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有_______________、____________。

（3）該質(zhì)�？杀�A、B、C三種限制性內(nèi)切酶同時切割。單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500 bp和1個2 666 bp片段，B和C同時切割得2個250 bp和1個3 166 bp片段。若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為________，C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為________、________

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構(gòu)建過程中把兩個啟動子串聯(lián)在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是_________________________。溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時具有抑制啟動子的活性，在42℃時失活。促進工程菌目的基因表達的誘導溫度為________。

Answer 1

【答案】構(gòu)建目的基因的表達載體 多個限制性內(nèi)切酶的切割位點 標記基因 750 bp 500 bp 1 000 bp 保證目的基因的高水平表達（高效轉(zhuǎn)錄） 42℃

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

2、基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

3、將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

4、目的基因的檢測與鑒定：

（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建目的基因的表達載體。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有具有多個限制性內(nèi)切酶的切割位點（便于目的基因的插入）、標記基因（便于鑒定和篩選含有目的基因的受體細胞）。

（3）單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，這說明該質(zhì)粒上有一個A酶切割位點、一個B酶切割位點、2個C酶切割位點。A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，說明A和C酶的一個切點之間的長度為500bp，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明B和C酶的一個切點之間的長度為250bp，若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為500+250=750bp，C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為500bp、1000bp。

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構(gòu)建過程中把兩個啟動子串聯(lián)在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是保證目的基因的高水平表達（高效轉(zhuǎn)錄）．溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時具有抑制啟動子的活性，在42℃時失活，因此要促進工程菌目的基因表達就要使CIts蛋白失活，即促進工程菌目的基因表達的誘導溫度為42℃。