Question

【題目】(一)漆酶屬于木質降解酶類，在環(huán)境修復、農業(yè)生產等領域有著廣泛用途。下圖是分離、純化和保存漆酶菌株的過程。

(1)在步驟①中，用_______稀釋制成不同濃度的樣品懸液。

(2)步驟②中將保存在70%酒精中的___________放在酒精燈火焰上，待火焰熄滅，將菌液涂布到整個

平面，將培養(yǎng)皿___________在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448小時，觀察菌落數(shù)。

(3)步驟③應選擇挑取涂布平板上長出的__________，再通過劃線進一步_______________。

(4)步驟④中，將菌種接種在_____________培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，置于_______冰箱中保存。

(5)若該漆酶大量應用于環(huán)境修復，可先用石英砂對漆酶進行_________(A.包埋B.共價偶聯(lián)C.吸附D.交聯(lián))法固定，再進行工業(yè)化使用。

(二)經研究表明，在多種腫瘤細胞中的TOP2A蛋白大量表達，因此成為抗腫瘤的研究靶點，某科研單位制作了TOP2A蛋白的單克隆抗體。請回答：

(1)利用基因工程制備TOP2A蛋白：將TOP2A蛋白基因和質粒用___________處理并連接成重組質粒，然后導入經_________處理的大腸桿菌，并將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經離心得到菌體，破碎提純得到TOP2A蛋白。

(2)TOP2A蛋白單克隆抗體的制備:將TOP2A蛋白反復多次注射到小鼠體內，使其發(fā)生_________，取經過免疫的小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞在物質_________介導下發(fā)生細胞融合，形成雜交瘤細胞。并將各雜交瘤細胞單獨分裝培養(yǎng)，經篩選、___________后，獲得能產生單一抗體的__________(A.連續(xù)細胞系B.有限細胞系C.連續(xù)細胞株D.有限細胞株）。

Answer 1

【答案】 無菌水 玻璃刮刀 倒置 單菌落 純化 斜面 4°C C DNA連接酶和限制性核酸內切酶 CaCl2 免疫反應 聚乙二醇 克隆培養(yǎng) C

【解析】本題考查微生物分離計數(shù)及單克隆抗體技術等相關知識，微生物培養(yǎng)的關鍵是防治雜菌污染，微生物接種的常用方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，結合圖中的“涂布”可判斷出本題使用的是稀釋涂布平板法；相對于細胞來說，酶分子更小，更適合于使用吸附法固定；單克隆抗體制備過程中，需對融合后的細胞進行培養(yǎng)并進行兩次篩選，才能得到分泌特定抗體的雜交瘤細胞。

(一) (1)結合題意分析過程圖可知，步驟①是制取樣品懸液，要用無菌水稀釋制成不同濃度的樣品懸液，以避免混入其它雜菌。

(2)步驟②是涂布過程，應將保存在70%酒精中的玻璃刮刀（涂布器）放在酒精燈火焰上，待火焰熄滅，將菌液涂布到整個平面，然后將培養(yǎng)皿倒置在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448小時，觀察菌落數(shù)。

(3)步驟③應選擇挑取涂布平板上長出的單菌落，再通過劃線進一步純化。

(4)步驟④中，將菌種接種在斜面培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，置于4°C冰箱中低溫保存菌種。

(5)酶分子較細胞小，一般使用吸附法固定，若該漆酶大量應用于環(huán)境修復，可先用石英砂對漆酶進行吸附法固定，再進行工業(yè)化使用。

(二) (1)基因工程中，構建重組質粒時需使用DNA連接酶和限制性核酸內切酶處理，將目的基因（TOP2A蛋白基因）與質粒相連形成重組質粒；將目的基因導入大腸桿菌的方法是用CaCl2處理，使大腸桿菌細胞處于感受態(tài)，從而目的基因導入大腸桿菌；將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經離心得到菌體，破碎提純得到TOP2A蛋白。

(2) 制備TOP2A蛋白單克隆抗體時，先將TOP2A蛋白反復多次注射到小鼠體內，使其發(fā)生免疫反應；再取經過免疫的小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞在聚乙二醇介導下發(fā)生細胞融合，形成雜交瘤細胞；然后將各雜交瘤細胞單獨分裝培養(yǎng)，經篩選、克隆培養(yǎng)后，即可獲得能產生單一抗體的連續(xù)細胞株。