Question

【題目】酵母菌的蛋白質(zhì)可作為飼料蛋白的來源，有些酵母菌能以工業(yè)廢甲醇作為碳源，研究人員擬從土壤樣品中分離出可利用工業(yè)廢甲醇的酵母菌，這樣既能減少污染又可變廢為寶。下圖為主要操作流程示意圖。

回答下列問題：

（1）配制培養(yǎng)基時(shí)，按照培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的____，及時(shí)對培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌：在加熱排除高壓鍋內(nèi)原有的____后，將高壓鍋密閉，繼續(xù)加熱，通常在____的條件下，維持15-30min，可達(dá)到良好的滅菌效果。

（2）取步驟②中梯度稀釋后的適量液體加入無菌培養(yǎng)皿，然后將高壓蒸汽滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至____（25℃/50℃/80℃）左右時(shí)倒入培養(yǎng)皿混勻（步驟⑧），冷凝后將培養(yǎng)皿倒置，在適宜的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間。

（3）挑取平板中長出的單菌落，按步驟④所示進(jìn)行劃線純化，下列敘述合理的是____。

a．為保證無菌操作，接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌

b．挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)菌落，分別測定酵母細(xì)胞中甲醇的含量

c．劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基表面，以確保能正常形成菌落

d．第二區(qū)以后的劃線起始端要與上一區(qū)的劃線的末端相連接，最后一區(qū)的劃線末端不能與第一區(qū)的劃線相連

（4）步驟⑤的培養(yǎng)中，應(yīng)加入 ___作為碳源，并加入適量的氮源、無機(jī)鹽和水等成分。為監(jiān)測發(fā)酵罐中酵母菌活細(xì)胞的密度，取2mL發(fā)酵液稀釋1000倍后，加入等體積臺盼藍(lán)染液染色，用如圖所示的計(jì)數(shù)室規(guī)格為25x16型的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，要達(dá)到每毫升4x109個(gè)活酵母菌細(xì)胞的預(yù)期密度，理論上，圖中標(biāo)號①～⑤五個(gè)中格里的呈____色的酵母菌細(xì)胞總數(shù)應(yīng)不少于____個(gè)。

Answer 1

【答案】pH 冷空氣 （壓力為）100kPa、（溫度為）121℃ 50℃ a、c、d 工業(yè)廢甲醇 無 40

【解析】

1、微生物常見的接種的方法：①平板劃線法：將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養(yǎng)。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成單個(gè)菌落。

②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經(jīng)過大量稀釋后，均勻涂布在培養(yǎng)皿表面，經(jīng)培養(yǎng)后可形成單個(gè)菌落。

2、分析題圖：①稱量土樣，里面含有需要分離的酵母菌；②表示梯度稀釋和涂布平板；③④表示平板劃線法，進(jìn)行純化培養(yǎng)；⑤表示擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得更多的酵母菌。

（1）配制培養(yǎng)基時(shí)，按照培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱量、溶化，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，及時(shí)對培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，高壓蒸汽滅菌。在加熱排除高壓鍋內(nèi)原有的冷空氣后，將高壓鍋密閉，繼續(xù)加熱，通常在（壓力為）100kPa、（溫度為）121℃的條件下，維持15-30min，可達(dá)到良好的滅菌效果。

（2）倒平板需要將培養(yǎng)基冷卻至50℃進(jìn)行。

（3）a、接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌，做到無菌操作，a正確；

b、挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)菌落，分別測定培養(yǎng)液中，而不是細(xì)胞內(nèi)甲醇的含量，b錯(cuò)誤；

c、劃線時(shí)應(yīng)避免劃破培養(yǎng)基表面，否則大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，c正確；

d、第二區(qū)域以后的劃線區(qū)域的菌種來源于上一區(qū)域的末端，所以第二區(qū)以后的劃線起始端要與上一區(qū)的劃線的末端相連接，并且最后一區(qū)的劃線末端不能與第一區(qū)的劃線相連，d正確，以便于分離菌落。

故選acd。

（4）本實(shí)驗(yàn)的目的是分離出可利用工業(yè)廢甲醇的酵母菌，所以應(yīng)該以甲醇作為碳源，活細(xì)胞膜具有選擇透過性，經(jīng)等體積臺盼藍(lán)染液染色，無色細(xì)胞才計(jì)數(shù)；為監(jiān)測酵母的活細(xì)胞密度，將發(fā)酵液稀釋1000倍后，經(jīng)等體積臺盼藍(lán)染液染色，用25×16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)，達(dá)到每毫升4×109個(gè)活細(xì)胞的預(yù)期密度，則n÷80×400÷（0.1×103）×2000=4×109，則5個(gè)中方格中無色酵母菌不少于40。