Question

【題目】華蟾素注射液是將蟾蜍的全皮陰干后，提煉而成的中藥復方制劑，是我國經(jīng)典抗腫瘤藥物。 研究人員為探尋華蟾素注射液抗肝癌 HepG-2 細胞的作用機理，進行了一系列實驗。請根據(jù)題中信息回答下列問題。

Ⅰ.肝癌 HepG-2 細胞的培養(yǎng)：

（1）培養(yǎng)肝癌HepG-2細胞時，在培養(yǎng)基中加入適量的__________以補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)，為防止培養(yǎng)過程發(fā)生污染要加入____________。此外，每 48h 更換 1 次培養(yǎng)液，目的是________________。

Ⅱ.探究華蟾素藥效作用機理的實驗：

（2）用不同濃度的華蟾素注射液分別處理 HepG-2 細胞 12h、24h 和 48h，測定華蟾素注射液對 HepG-2 細胞增殖的影響，結(jié)果如下圖。

由圖甲可知，華蟾素能有效地______肝癌HepG-2細胞增殖，且與______呈正相關(guān)。圖乙的結(jié)果進一步表明，華蟾素對肝癌HepG-2細胞增殖的影響體現(xiàn)在______________。

（3）DNA 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（簡稱 TopoⅡ）為真核生物所必需，在 DNA 復制、轉(zhuǎn)錄、重組及形成正確的染 色體結(jié)構(gòu)、染色體分離、濃縮等方面發(fā)揮重要作用，TopoⅡ在腫瘤細胞中含量明顯高于正常細胞。 華蟾素注射液處理 HepG-2 細胞 48h 后，采用 RT-PCR 技術(shù)檢測 TopoⅡ基因的表達情況，RT﹣PCR是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式反應相結(jié)合的技術(shù)，具體過程如圖丙。

①RT-PCR 即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應。其主要原理是：提取HepG-2 細胞中的總 RNA， 以一段_______作為引物，在________酶的作用下合成 cDNA，再以 cDNA 為模板進行_________。

②要對圖中單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上至少需要___________個引物B。

Answer 1

【答案】血清（血漿） 抗生素 防止代謝物質(zhì)的積累對細胞自身造成危害 抑制 作用時間和濃度 將癌細胞阻滯在S期 與TopoⅡMrna互補的單鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴增 2n-1

【解析】

1、動物細胞培養(yǎng)的條件：（1）無菌、無毒的環(huán)境：①消毒、滅菌；②添加一定量的抗生素；③定期更換培養(yǎng)液，以清除代謝廢物。（2）營養(yǎng)物質(zhì)：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等，還需加入血清、血漿等天然物質(zhì)。（3）溫度和PH：36.5℃±0.5℃；適宜的pH：7.2～7.4。（4）氣體環(huán)境：95%空氣（細胞代謝必需的）和5%的CO2（維持培養(yǎng)液的PH）。

2、逆轉(zhuǎn)錄是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以RNA為模板合成DNA的過程。

3、PCR技術(shù)可在體外大量擴增目的基因。

Ⅰ．（1）動物細胞培養(yǎng)時，為了補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)，應該在培養(yǎng)基中加入適量的血清（血漿）；為防止培養(yǎng)過程發(fā)生污染要加入抗生素；此外，每48h更換1次培養(yǎng)液，目的是防止代謝物積累對細胞自身造成危害（補充細胞所需營養(yǎng)物質(zhì)）。

Ⅱ．（2）根據(jù)圖1可知，華蟾素能有效地抑制肝癌HepG-2細胞增殖，且與作用時間和濃度呈正相關(guān)；圖乙的結(jié)果進一步表明，使用華蟾素后，S期細胞比例增多，因此對肝癌HepG-2細胞增殖的影響體現(xiàn)在將癌細胞阻滯在S期。

（3）①RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應，其主要原理是：提取HepG-2細胞中的總RNA，以一段與TopoⅡmRNA互補的單鏈DNA作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。

②由圖丙可知，要對圖中單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，結(jié)果共形成2n個DNA，每個DNA兩條鏈，因此理論上至少需要的引物B數(shù)量=（2n×2-2）×2=2n -1（個）。