Question

【題目】人類胰島素基因位于第11號染色體上，長度8416 bp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，人類胰島素的氨基酸序列已知。回答相關(guān)問題：

（1）上圖是利用PCR技術(shù)獲取人胰島素基因的方法，該過程在緩沖液中除了要添加模板和引物外，還需要添加的物質(zhì)有_________，一個DNA分子經(jīng)過5輪循環(huán)，需要引物A____個，從PCR的過程和DNA分子的特點(diǎn)，試著寫出設(shè)計引物需要注意的問題（答出2點(diǎn)即可）_____________________________________________。

（2）基因工程中需要DNA連接酶，根據(jù)酶的來源不同分為兩類，其中“縫合”雙鏈DNA片段平末端的是______________________，利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于____________________________。

（3）將獲得的胰島素基因?qū)�入大腸桿菌體內(nèi)，一般先用_______處理大腸桿菌細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于_________中與該類細(xì)胞混合，在一定溫度下促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA分子完成轉(zhuǎn)化過程。

（4）若利用圖示方法獲取的胰島素基因，直接構(gòu)建基因表達(dá)載體后導(dǎo)入大腸桿菌，能不能表達(dá)出人胰島素，說明理由。___________________________________________。

Answer 1

【答案】四種脫氧核苷酸和熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶） 31 引物自身不能有互補(bǔ)序列、引物之間不能有互補(bǔ)序列、引物長度適當(dāng)、引物能與目的基因兩側(cè)特異性結(jié)合、避免與擴(kuò)增DNA內(nèi)有過多互補(bǔ)的序列 T4DNA連接酶 DNA分子的大小 Ca2+ 緩沖液 不能，因?yàn)榇朔椒ǐ@得的目的基因中含有內(nèi)含子，大腸桿菌無法正常識別內(nèi)含子而對內(nèi)含子部分轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行翻譯，所以合成的蛋白質(zhì)會出現(xiàn)錯誤

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。�2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（4）目的基因的檢測與鑒定。

2、采用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程為：變性、退火、延伸。

3、PCR技術(shù)的原理是模擬生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程，利用DNA分子熱變形原理，通過控制溫度控制控制DNA分子的解聚和結(jié)合，DNA分子體內(nèi)復(fù)制過程DNA的解旋是在解旋酶的作用下實(shí)現(xiàn)的；PCR擴(kuò)增DNA片段過程最高經(jīng)過n次擴(kuò)增，形成的DNA分子數(shù)是2n個，其中只有2條單鏈不含有引物。

（1）用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時所需的條件：引物、模板DNA（目的基因或A基因）、原料（4種脫氧核糖核苷酸）和耐熱性的DNA聚合酶等。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，此技術(shù)的前提是具有一段已知目的基因的核苷酸序列。根據(jù)PCR過程的特點(diǎn)可知，第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即僅含引物之間的序列，因此，經(jīng)過3輪循環(huán)可以得到所需的目的基因。循環(huán)5次，理論上至少需要26-2=62個引物，其中A引物31個。引物設(shè)計時需要注意以下幾點(diǎn)：引物自身不能有互補(bǔ)序列；引物之間不能有互補(bǔ)序列；引物長度適當(dāng)；引物能與目的基因兩側(cè)特異性結(jié)合；避免與擴(kuò)增DNA內(nèi)有過多互補(bǔ)的序列。

（2）連接DNA片段平末端的酶是T4DNA連接酶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)中分子的遷移速率主要取決于分子的大小，因此利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于DNA分子的大小。

（3）將人工合成的目的基因?qū)�入大腸桿菌體內(nèi)，一般先用鈣離子處理大腸桿菌使之成為感受態(tài)細(xì)胞。再將重組DNA溶于緩沖液中與該類細(xì)胞融合，在一定溫度下促進(jìn)細(xì)胞吸收重組DNA分子完成轉(zhuǎn)化過程。

（4）題干信息顯示圖示獲取的目的基因含有外顯子和內(nèi)含子，因此直接將含有此目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌并不能表達(dá)出胰島素，原因是大腸桿菌無法正常識別內(nèi)含子而對內(nèi)含子部分轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行翻譯，導(dǎo)致合成的蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯誤。