Question

【題目】轉(zhuǎn)染是指利用一定手段使外源基因進(jìn)入細(xì)胞中并穩(wěn)定表達(dá)的過程。腺病毒載體常用于外源基因的轉(zhuǎn)染，這在基因治療、疫苗研發(fā)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的可視化監(jiān)控方面有著廣闊的應(yīng)用前景�；卮鹣铝袉栴}。

（l）腺病毒營____活，用作轉(zhuǎn)染的腺病毒載體上具有____識別和結(jié)合的部位，是外源基因在受體細(xì)胞中啟動表達(dá)的關(guān)鍵。

（2）構(gòu)建腺病毒載體時，先用同種限制酶對腺病毒DNA和外源基因進(jìn)行切割，可獲得相同的____，再用DNA連接酶恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的___。

（3）通過腺病毒載體將藍(lán)色熒光基因轉(zhuǎn)染山羊耳緣成纖維細(xì)胞，利用藍(lán)色熒光直觀監(jiān)控細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程。首先將山羊耳緣組織塊用胰蛋白酶或_______處理得到單個成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至貼滿瓶壁時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為________。這時，重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)進(jìn)行 _______培養(yǎng)。培養(yǎng)時使用的合成培養(yǎng)基，通常需加入 ___等一些天然成分，以滿足細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的全面需求。

Answer 1

【答案】寄生 RNA聚合酶 黏性末端或平末端 磷酸二酯鍵 膠原蛋白酶 細(xì)胞的接觸抑制 傳代 血清、血漿

【解析】

1、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。構(gòu)建基因表達(dá)載體時需要用同種限制酶切割目的基因和載體，以產(chǎn)生相同的末端，然后用DNA連接酶連接，恢復(fù)被切開的核苷酸之間的磷酸二酯鍵，RNA聚合酶能夠與啟動子識別并結(jié)合催化轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，這是是外源基因在受體細(xì)胞中啟動表達(dá)的關(guān)鍵。

2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細(xì)胞→制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細(xì)胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

（1）腺病毒屬于動物病毒，其無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，營寄生生活，必須寄生于宿主的活細(xì)胞中才能繁殖；用作轉(zhuǎn)染的腺病毒載體上應(yīng)具有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位啟動子，這樣才能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄形成mRNA，最終合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

（2）構(gòu)建腺病毒載體時，先用同種限制酶對腺病毒DNA和外源基因進(jìn)行切割，可以獲得相同的黏性末端或平末端，再用DNA連接酶恢復(fù)被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）對山羊耳緣組織塊用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理得到單個成纖維細(xì)胞，便于細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸；培養(yǎng)至貼滿瓶壁時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制；這時重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；由于人們對動物細(xì)胞培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此培養(yǎng)時使用的合成培養(yǎng)基，通常需加入血漿、血清等一些天然成分，以滿足細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的全面要求。