Question

【題目】人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，但是大劑量使用會誘發(fā)顱內(nèi)出血。如果將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。先對天然的t-PA基因進行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。下圖表示通過重疊延伸PCR技術獲取t-PA改良基因和構建含t-PA改良基因重組質(zhì)粒的過程示意圖。圖中重疊延伸PCR過程中，引物a、b被用來擴增含有突變位點及其上游序列的DNA片段，引物c、d被用來擴增含突變位點及其下游序列的DNA片段。請回答：

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相應的基因模板鏈（圖中t-PA基因的上鏈）上的堿基序列是ACA，絲氨酸的密碼子是UCU。重疊延伸PCR示意圖中的黑點表示突變部位的堿基，引物b中該部位的堿基是______，引物c該部位的堿基是______。PCR中需要引物的原因是______。

（2）重疊延伸PCR中，PCR1和PCR2分別進行，產(chǎn)物混合后再進行PCR3。PCR1和PCR2需要分別進行的原因是______。

（3）構建重組質(zhì)粒時，選用的限制酶是______。重組質(zhì)粒中的新霉素抗性基因的作用是______。

（4）在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細胞并非都是目的菌株，需選擇呈______色的菌落，進一步培養(yǎng)、檢測和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生產(chǎn)改良t-PA蛋白的技術屬于______工程。

Answer 1

【答案】G C DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈 引物b和引物c可以互補配對，導致引物失效 XmaⅠ和BglⅡ 便于將導入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來 白 蛋白質(zhì)

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

（3）將目的基因導入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。也就是說，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程領域。

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相應的基因模板鏈（圖中t-PA基因的上鏈）上的堿基序列是ACA，絲氨酸的密碼子是UCU。由此可知基因模板鏈第84為發(fā)生堿基替換為ACA→AGA，即t-PA基因的上鏈中相應位置的ACA→AGA，圖中顯示引物b與t-PA基因的下鏈互補，故其中相應部位的堿基與上鏈相同，即該部位的堿基是G，引物c與t-PA基因的上鏈互補，故其中相應部位的堿基與下鏈相同，即該部位的堿基是C，由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此 PCR中需要加入合適的引物來完成子鏈延伸。

（2）圖中信息顯示，引物b和引物c可以互補配對，因此，如果PCR1和PCR2同時進行，無法達到預期目的。

（3）根據(jù)圖中目的基因兩端的黏性末端以及各種限制酶的的切割位點可知，在構建重組質(zhì)粒時，選用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，才能與目的基因t-PA改良基因高效連接。在構建重組質(zhì)粒時，其中的新霉素抗性基因沒有被破壞，因此可以根據(jù)對新霉素的抗性將成功導入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來，即該基因的作用是便于將成功導入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來。

（4）在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細胞應該包含兩種類型，一類是導入質(zhì)粒的大腸桿菌，這類大腸桿菌細胞因為含有mlacZ基因而呈藍色；一類是導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，因為其中不含mlacZ基因，該細菌表現(xiàn)為白色，因此需選擇呈白色的菌落，進一步培養(yǎng)、檢測和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生產(chǎn)改良t-PA蛋白的技術屬于蛋白質(zhì)工程。