Question

6．回答下列有關(guān)生物工程的問(wèn)題．
Rag2基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細(xì)胞．科研人員利用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）對(duì)Rag2基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療，其技術(shù)流程如圖1（圖中數(shù)字序號(hào)表示的是相關(guān)過(guò)程）．

                          圖1

                                  圖2 
（1）在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核．
（2）過(guò)程②，重組胚胎培養(yǎng)到一定時(shí)期時(shí)，可從其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的ES細(xì)胞的特點(diǎn)是具有全能性，能夠分裂和分化形成所有組織和器官．
（3）過(guò)程③中，需要構(gòu)建含有Rag2基因的表達(dá)載體，具體過(guò)程如圖2．圖中Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^r表示四環(huán)素抗性基因，限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ切割形成的末端均不相同．可以根據(jù)Rag2基因的脫氧核苷酸序列（或核苷酸序列或遺傳信息）設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Rag2基因片段．為了使目的基因和質(zhì)粒定向連接并且有利于受體細(xì)胞的篩選，④過(guò)程采用的酶是PstI酶和EcoRI酶，⑤過(guò)程采用的酶是DNA連接酶．如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同時(shí)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割，假設(shè)同時(shí)只有任意兩個(gè)位點(diǎn)被切斷且每次機(jī)會(huì)相等，則形成的DNA片段有6種，其中含有完整四環(huán)素抗性基因的DNA片段占$\frac{1}{6}$．
（4）在ES細(xì)胞培養(yǎng)液中加入特定的促進(jìn)分化的因子可以體外誘導(dǎo)定向形成造血干細(xì)胞．
（5）為檢測(cè)Rag2基因的表達(dá)情況，可提取治療后小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)，用抗Rag2蛋白的抗體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)．

Answer 1

分析 1、動(dòng)物核移植的概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移入一個(gè)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體．
2、胚胎干細(xì)胞簡(jiǎn)稱ES或EK細(xì)胞，來(lái)源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）．
3、在基因工程中，目的基因和質(zhì)粒需要用同種限制酶進(jìn)行切割，形成相同的黏性末端，再用DNA連接酶連接成重組質(zhì)粒．
4、目的基因分子水平上的檢測(cè)：
①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)
②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)
③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)

解答 解：（1）核移植是將體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，所以實(shí)驗(yàn)前要去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核．
（2）囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞處于胚胎干細(xì)胞，具有全能性，能夠分裂和分化形成所有組織和器官．
（3）設(shè)計(jì)引物要遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，所以根據(jù)Rag₂基因的脫氧核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)．根據(jù)圖2中先用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選可知，四環(huán)素抗性基因沒(méi)有被破壞，破壞的是氨芐青霉素抗性基因，因此為了使目的基因和質(zhì)粒定向連接并且有利于受體細(xì)胞的篩選，④過(guò)程采用的酶是Pst I酶和EcoR I酶，⑤過(guò)程采用的酶是DNA連接酶．如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同時(shí)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割，假設(shè)同時(shí)只有任意兩個(gè)位點(diǎn)被切斷且每次機(jī)會(huì)相等，若Pst I酶的切割位點(diǎn)用1表示，EcoR I酶的切割位點(diǎn)用2表示，HindⅢ酶的切割位點(diǎn)用3表示，則形成的DNA片段1→2，2→1，2→3，3→2，1→3，3→1六種片段，其中只有2→1片段含有完整四環(huán)素抗性基因，即含有完整四環(huán)素抗性基因的DNA片段占$\frac{1}{6}$．
（4）在ES細(xì)胞培養(yǎng)液中加入特定的促進(jìn)分化的因子可以體外誘導(dǎo)定向形成造血干細(xì)胞．
（5）基因表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，因此為了檢測(cè)Rag2基因的表達(dá)情況，可以提取小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原-抗體雜交．
故答案為：
（1）卵母細(xì)胞
（2）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)     具有全能性，能夠分裂和分化形成所有組織和器官
（3）脫氧核苷酸序列（或核苷酸序列或遺傳信息）    Pst I酶和EcoR I酶     DNA連接酶     6     $\frac{1}{6}$
（4）特定的促進(jìn)分化的因子
（5）蛋白質(zhì)

點(diǎn)評(píng) 本題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細(xì)胞工程以及胚胎工程等方面的知識(shí)，難度適中．考生要能夠識(shí)記細(xì)胞核移植的過(guò)程；識(shí)記囊胚包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層兩部分；明確基因工程中質(zhì)粒和目的基因需要利用同種限制酶進(jìn)行切割；掌握目的基因檢測(cè)和鑒定的一般方法等．