Question

下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請分析回答下列問題．
資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達[5′AOX1和3′AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子]．
資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達．

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上

 

、

 

限制酶識別序列，這樣設(shè)計的優(yōu)點是避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化．
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用

 

將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取

 

．
（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶

 

來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細胞．
（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選，轉(zhuǎn)化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用

 

方法進行檢測．
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入

 

以維持其生活，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達．
（6）與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質(zhì)合成后，細胞可以對其進行

 

并分泌到細胞外，便于提�。�

Answer 1

考點：基因工程的原理及技術(shù)

專題：

分析：分析題圖：圖1所示為科學(xué)家改造后形成的pPIC9K質(zhì)粒，可用作基因工程的載體；圖2為含有目的基因（HBsAg）的外源DNA分子．首先用pPIC9K質(zhì)粒作載體，與目的基因形成的重組質(zhì)粒；步驟1表示將目的基因?qū)�入受體細胞的過程；步驟2表示目的基因隨著大腸桿菌的繁殖而擴增；步驟3表示切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細胞．

解答： 解：（1）重組質(zhì)粒上的目的基因若要表達，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子和終止子之間，只要在目的基因兩側(cè)的A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種限制酶對質(zhì)粒和目的基因同時進行切割，便會各自出現(xiàn)相同的黏性末端，便于重組與表達，同時可防止自身環(huán)化，因此在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置應(yīng)接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列．
（2）①用DNA連接酶可將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒；②將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，目的是利用大腸桿菌的無性繁殖，短時間內(nèi)獲取大量的重組質(zhì)粒．
（3）重組DNA的兩側(cè)分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其他限制酶均會破壞含有啟動子和終止子的目的基因．
（4）檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞常采用DNA分子雜交技術(shù)．
（5）資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時可誘導(dǎo)HBsAg基因表達．
（6）酵母菌為真核生物，細胞內(nèi)具有能對分泌蛋白進行加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器，而大腸桿菌等原核生物不具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器．
故答案為：
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA連接酶    大量重組質(zhì)粒
（3）BglⅡ
（4）DNA分子雜交
（5）甲醇
（6）加工（修飾）

點評：本題結(jié)合將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程圖，考查基因工程的原理及技術(shù)，要求考生識記基因工程的原理、工具及操作步驟，能結(jié)合題干和圖中信息答題，有一定難度．