Question

【題目】發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒是一種植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其有3個功能區(qū)：①T-DNA區(qū)是Ri質(zhì)粒上唯一整合到植物基因組上的DNA片段；②Vir毒性蛋白區(qū)是發(fā)根農(nóng)桿菌實現(xiàn)高效侵染所必需的區(qū)域；③Ori區(qū)即復(fù)制起始區(qū)與功能代謝區(qū)。常用的質(zhì)粒載體pCAMBIA1301在大腸桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中都能生存和克隆，并且自身攜帶潮霉素抗性基因以及可以替換T-DNA的DNA片段，經(jīng)處理后質(zhì)粒pCAMBIA1301也可具備T-DNA。部分轉(zhuǎn)化過程如圖所示。

請回答下列問題：

（1）限制性核酸內(nèi)切酶能識別圖中LB和RB的酶切位點，并能使1個pCAMBIA1301質(zhì)粒的_____個磷酸二酯鍵斷開。

（2）應(yīng)用過程中，將目的片段插入到pCAMBIA1301質(zhì)粒的_______________中，再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中。要確定重組質(zhì)粒是否被成功導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，可在培養(yǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌一段時間后，利用pCAMBIA1301上自身攜帶的_____________進行鑒定，也可利用基因探針通過_________________技術(shù)進行檢測。

（3）可分別用70%乙醇和_________________溶液浸泡處理植物組織，并使其脫分化形成愈傷組織，再用重組發(fā)根農(nóng)桿菌對其進行侵染，之后進行脫菌培養(yǎng)，然后以適當配比的________________________誘導(dǎo)，最終可獲得轉(zhuǎn)基因植株。

（4）圖中Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段有缺損，因此無法被轉(zhuǎn)化至植物細胞內(nèi)，但Ri質(zhì)粒上的__________仍可對侵染過程起到輔助激活作用。若Ri質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整，其功能類似于根瘤農(nóng)桿菌中的_______________。

Answer 1

【答案】4 T-DNA 潮霉素抗性基因 DNA分子雜交 5%次氯酸鈉 營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑 Vir毒性蛋白區(qū) Ti質(zhì)粒

【解析】

基因工程的操作步驟：

1.目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲��；（2）PCR擴增技術(shù)；（3）人工合成法。

2. 基因表達載體的構(gòu)建：①過程：用同一種限制酶切割目的基因和運載體，再用DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組DNA分子。②目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并且可以遺傳給下一代并表達和發(fā)揮作用。③基因表達載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因。

（1）啟動子在基因的首段，它是RNA聚合酶的結(jié)合位點，能控制著轉(zhuǎn)錄的開始；

（2）終止子在基因的尾端，它控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束；

（3）標記基因便于目的基因的鑒定和篩選。

3.將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（1）農(nóng)桿菌的特點：在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞，并且整合到染色體的DNA上。根據(jù)這一特點，如果將目的基因轉(zhuǎn)移到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，可以使目的基因進入植物細胞，并將其插入到植物細胞染色體的DNA上。

4.目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）限制酶能夠識別雙鏈DNA分子某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，因此限制性核酸內(nèi)切酶能識別圖中LB和RB的酶切位點，在pCAMBIA1301質(zhì)粒上切2個切口，使1個pCAMBIA1301質(zhì)粒的4個磷酸二酯鍵斷開。

（2）根據(jù)題意可知，經(jīng)處理后質(zhì)粒pCAMBIA1301也可具備T-DNA，將目的基因插入到T-DNA中，可以在T-DNA的作用下轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)染色體的DNA上，要確定重組質(zhì)粒是否被成功導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，可在培養(yǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌一段時間后，pCAMBIA1301上自身攜帶的潮霉素抗性基因?qū)儆跇擞浕�因，標記基因的作用是可以對重組DNA進行鑒定和選擇，也可在分子水平上利用基因探針通過DNA分子雜交技術(shù)，根據(jù)雜交帶的有無進行檢測發(fā)根農(nóng)桿菌細胞內(nèi)的DNA上有無目的基因的存在。

（3）在植物組織培養(yǎng)過程中，對外植體可分別用70%乙醇和5%次氯酸鈉溶液浸泡處理，并使其脫分化形成愈傷組織，再用重組發(fā)根農(nóng)桿菌對其進行侵染，之后進行脫菌培養(yǎng)，然后以適當配比的營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑（生長素類和細胞分裂素類）誘導(dǎo)，最終可獲得轉(zhuǎn)基因植株。

（4）根據(jù)題意可知，圖中Ri質(zhì)粒上有3個功能區(qū)：①T-DNA區(qū)是Ri質(zhì)粒上唯一整合到植物基因組上的DNA片段；②Vir毒性蛋白區(qū)是發(fā)根農(nóng)桿菌實現(xiàn)高效侵染所必需的區(qū)域；③Ori區(qū)即復(fù)制起始區(qū)與功能代謝區(qū)。如果Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段有缺損，因此無法被轉(zhuǎn)化至植物細胞內(nèi)，但Ri質(zhì)粒上的Vir毒性蛋白區(qū)是發(fā)根農(nóng)桿菌實現(xiàn)高效侵染所必需的區(qū)域，仍可對侵染過程起到輔助激活作用。若Ri質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整，其功能類似于根瘤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒。