Question

【題目】下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程及有關資料，請分析回答下列問題。

資料1　巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導而表達[5'AOX1和3'AOX1(TT)分別是基因AOX1的啟動子和終止子]。

資料2　巴斯德畢赤酵母菌體內無天然質粒，所以科學家改造出了圖1所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達。

(1)如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上______、______限制酶識別序列， 這樣設計的優(yōu)點是避免質粒和目的基因自身環(huán)化。

(2)酶切獲取HBsAg基因后，需用________將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取_______ _。

(3)步驟3中應選用限制酶________來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

(4)為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養(yǎng)基中應該加入卡拉霉素以便篩選，轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用_____ ___方法進行檢測。

(5)轉化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入____ ____以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

(6)與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行___ _____并分泌到細胞外，便于提取。

Answer 1

【答案】(1)SnaBⅠ　AvrⅡ　(2)DNA連接酶　大量重組質�！�(3)BglⅡ　(4)DNA分子雜交　(5)甲醇　(6)加工(修飾)

【解析】

(1)重組質粒上的目的基因若要表達，目的基因的首端和尾端需含有啟動子和終止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側的A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種限制酶對質粒和目的基因同時進行切割，便會各自出現(xiàn)相同的黏性末端，便于重組與表達，同時可防止自身環(huán)化，因此在HBsAg基因兩側的A和B位置應接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列。

(2)用DNA連接酶可將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質粒連接成重組質粒；將重組質粒導入大腸桿菌體內的目的是：利用大腸桿菌的無性繁殖，短時間內獲取大量的重組質粒。

(3)重組DNA的兩側分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其他限制酶均會破壞含有啟動子、終止子的目的基因。所以步驟3中應選用限制酶BglⅡ來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

(4)可用DNA分子雜交技術檢測巴斯德畢赤酵母菌內是否導入了目的基因。

(5)資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時可誘導HBsAg基因表達，據此可知：轉化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

(6) 大腸桿菌等細菌為原核生物，細胞內沒有對分泌蛋白進行加工修飾的內質網和高爾基體，而巴斯德畢赤酵母菌為真核生物，其細胞內有內質網和高爾基體等復雜的細胞器。所以與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行加工修飾并分泌到細胞外，便于提取。