Question

12．某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因．利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過(guò)程如圖1所示，請(qǐng)回答下列問(wèn)題．

（1）將抗鹽基因?qū)�入煙草�?xì)胞內(nèi)，使煙草植株產(chǎn)生抗鹽性狀，這種新性狀（變異性狀）的來(lái)源屬于基因重組．
（2）在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用SalⅠ和HindⅢ（填SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ）兩種酶對(duì)質(zhì)粒和含抗鹽基因的DNA進(jìn)行切割，以保證重組DNA序列的唯一性．
（3）基因工程中的檢測(cè)篩選是一個(gè)重要的步驟．為篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，圖2表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法（使一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法）檢測(cè)基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入了農(nóng)桿菌．培養(yǎng)基除了含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有氨芐青霉素、四環(huán)素．
從檢測(cè)篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是4和6（填序號(hào)）菌落中的細(xì)菌．為了確定抗鹽煙草是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)抗鹽基因，又要用一定濃度的鹽水澆灌煙草植株的方法從個(gè)體水平鑒定煙草植株的耐鹽性．
（4）將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細(xì)胞培育成完整的植株需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，愈傷組織經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)而形成完整植株，此過(guò)程除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加植物激素．
（5）圖3表示該抗蟲(chóng)水稻主要培育流程，據(jù)圖回答：組建理想的載體需要對(duì)天然的質(zhì)粒進(jìn)行改造．圖4是天然土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（圖示部分基因及部分限制性?xún)?nèi)切酶作用位點(diǎn)），據(jù)圖分析：
①人工改造時(shí)，要使抗蟲(chóng)基因表達(dá)，還應(yīng)插入啟動(dòng)子．
②人工改造時(shí)用限制酶Ⅱ處理，其目的之一是去除質(zhì)粒上的tms和tmr（基因），保證T-DNA進(jìn)入水稻細(xì)胞后不會(huì)引起細(xì)胞的無(wú)限分裂和生長(zhǎng)．
③若用限制酶Ⅰ分別切割改造過(guò)的理想質(zhì)粒和帶有抗蟲(chóng)基因的DNA分子，并構(gòu)成重組Ti質(zhì)粒．分別以含四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)已成功導(dǎo)入抗蟲(chóng)基因的水稻胚細(xì)胞，觀(guān)察到的細(xì)胞生長(zhǎng)的現(xiàn)象是在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)．

Answer 1

分析 根據(jù)題意和圖示分析可知：圖1所示為轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，首先構(gòu)建基因表達(dá)載體；其次采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（煙草細(xì)胞）；再采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將含有目的基因的煙草細(xì)胞培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草．
圖2所示為篩選含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的過(guò)程，培養(yǎng)基A和B中應(yīng)該分別加入氨芐青霉素、四環(huán)素．
圖3所示，①時(shí)基因表達(dá)載體的構(gòu)建，②將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，③用農(nóng)桿菌侵染水稻胚細(xì)胞，④植物組織培養(yǎng)．
圖4是基因表達(dá)載體，其組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因．標(biāo)記基因可以篩選出含有目的基因的細(xì)胞．

解答 解：（1）基因工程的原理是基因重組．
（2）由于BamHⅠ酶識(shí)別的DNA序列在抗鹽基因中間，用該酶切割會(huì)破壞目的基因，所以在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用SalⅠ和HindⅢ兩種酶對(duì)質(zhì)粒和含抗鹽基因的DNA進(jìn)行切割，以保證重組DNA序列的唯一性．
（3）用SalI和HindⅢ兩種限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，但不會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生存，但不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生存．所以培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有氨芐青霉素、四環(huán)素，含目的基因的是4和6菌落中的細(xì)菌．探針是指用放射性同位素標(biāo)記的目的基因（抗鹽基因）．除了從分子水平上進(jìn)行檢測(cè)，還可以從個(gè)體水平上進(jìn)行鑒定，即用一定濃度的鹽水澆灌煙草植株來(lái)鑒定煙草的耐鹽性．
（4）將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細(xì)胞培育成完整的植株需要利用植物細(xì)胞的全能性，用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，愈傷組織經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)而形成完整植株，此過(guò)程除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加適宜比例的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素．
（5）①基因表達(dá)載體組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因，要使抗蟲(chóng)基因能成功表達(dá)，還應(yīng)插入啟動(dòng)子．
②tms的編碼產(chǎn)物控制合成吲哚乙酸和tmr的編碼產(chǎn)物控制合成細(xì)胞分裂素．因此用限制酶Ⅱ處理tms和tmr基因，可以保證T-DNA進(jìn)入水稻細(xì)胞后不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)．
③若用限制酶Ⅰ分別切割經(jīng)過(guò)②過(guò)程，破壞了四環(huán)素抗性基因，受體細(xì)胞不具有抗四環(huán)素功能，但可以抗卡那霉素．分別以含四環(huán)素和卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)已成功導(dǎo)入抗蟲(chóng)基因的水稻胚細(xì)胞，觀(guān)察到的細(xì)胞在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)．
故答案為：
（1）基因重組
（2）SalⅠHindⅢ
（3）氨芐青霉素　四環(huán)素（氨芐青霉素和四環(huán)素）　4和6　抗鹽基因
（4）植物組織培養(yǎng)　　植物激素
（5）①啟動(dòng)子
②tms和tmr
③在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、工具及操作步驟，能根據(jù)圖中限制酶的位置及題干要求選擇正確的限制酶；能根據(jù)題中信息判斷培養(yǎng)基中抗生素的名稱(chēng)；識(shí)記植物組織培養(yǎng)過(guò)程及條件．