Question

13．下面是將乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請(qǐng)分析回答下列問題．
資料1：巴斯德畢赤酵母菌可用培養(yǎng)基中甲醇作為其生活的唯一碳源，同時(shí)AOX1基因（醇氧化酶基因）受到誘導(dǎo)而表達(dá)，5'AOX1和3'AOXl（TT）是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子，此啟動(dòng)子也能使外源基因高效表達(dá)．
資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，下圖為科學(xué)家改造的pPIC9K質(zhì)粒，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒在特定部位酶切后形成的重組DNA片段可以整合到酵母菌染色體上，最終實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)．

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠAvrⅡ限制酶識(shí)別序列（SnaB I、Avr II、SacI、Bgl II四種限制酶的識(shí)別序列均不相同），這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化．
（2）酶切獲取HBsA9基因后，需用DNA連接酶將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，根據(jù)步驟②可知步驟①將重組質(zhì)粒先導(dǎo)入大腸桿菌的目的是導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，目的是利用大腸桿菌無(wú)性繁殖速度，短時(shí)間內(nèi)可獲取大量的重組質(zhì)粒．．
（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割從大腸桿菌分離的重組質(zhì)粒從而獲得圖中所示的重組DNA片段，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞．
（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選．
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsA9基因表達(dá)．
（6）與大腸桿菌等細(xì)菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在蛋白質(zhì)合成后，細(xì)胞可以對(duì)其進(jìn)行加工（修飾）并分泌到細(xì)胞外，便于提�。�
（7）培育轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞所利用的遺傳學(xué)原理是基因重組．

Answer 1

分析 分析題圖：圖中質(zhì)粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點(diǎn)，其中SacI位于啟動(dòng)子上，BglⅡ位于終止子上．要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質(zhì)粒，要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培養(yǎng)基中加入卡那霉素以便篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的目的菌．

解答 解：（1）重組質(zhì)粒上的目的基因若要表達(dá)，需要目的基因的首尾含有啟動(dòng)子和終止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ識(shí)別的序列在啟動(dòng)子與終止子之間，只要在目的基因兩側(cè)A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因同時(shí)切割，便會(huì)各自出現(xiàn)相同的粘性末端，便于重組與表達(dá)．
（2）①用DNA連接酶將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒；步驟①將重組質(zhì)粒先導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，目的是利用大腸桿菌無(wú)性繁殖速度，短時(shí)間內(nèi)可獲取大量的重組質(zhì)粒．
（3）重組DNA的兩側(cè)分別是啟動(dòng)子和終止子，除BglⅡ外，其它限制酶會(huì)破壞含有啟動(dòng)子、終止子的目的基因．
（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，則導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗卡那霉素，所以為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡那霉素以便篩選．轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子雜交方法進(jìn)行檢測(cè)．
（5）巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時(shí)甲醇能誘導(dǎo)AOX1基因表達(dá)．所以轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)．
（6）酵母菌為真核生物，細(xì)胞內(nèi)具有對(duì)分泌蛋白加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，細(xì)菌等原核生物，不具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器．
（7）培育轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞所利用的遺傳學(xué)原理是基因重組．
故答案為：
（1）SnaBⅠAvrⅡ避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化（或任意連接）
（2）DNA連接酶　利用大腸桿菌無(wú)性繁殖速度，短時(shí)間內(nèi)可獲取大量的重組質(zhì)粒
（3）BglⅡ
（4）卡拉霉素
（5）甲醇
（6）加工（修飾）
（7）基因重組

點(diǎn)評(píng) 本題考查了基因工程應(yīng)用的關(guān)知識(shí)，考查了學(xué)生對(duì)相關(guān)知識(shí)的理解和掌握情況，對(duì)圖表的分析判斷能力．培養(yǎng)學(xué)生搜集和處理科學(xué)信息的能力，思維能力，分析和解決問題的能力，具有一定的難度．